摘 要

目的

使用串联质谱标签(TMT)方法筛选甲状腺相关眼病(TAO)继发限制性斜视患者和共同性斜视患者的眼外肌差异表达蛋白。

方法

收集2019年8月至2020年12月于北京大学人民医院眼科诊断为TAO继发限制性斜视并行斜视矫正术5例患者的眼外肌标本，收集同期5例共同性内斜视行斜视矫正术患者的眼外肌作为对照。采用基于TMT的蛋白质组学技术，对TAO组和对照组眼外肌的差异表达蛋白进行筛选及生物信息学分析。设定倍数变化≥1.2或≤0.83且P值

结果

TAO组与对照组眼外肌总差异表达蛋白数量为53个，其中表达上调蛋白34个，表达下调蛋白19个。通过GO注释发现，按其生物学过程分类，这些差异表达蛋白主要参与了对刺激的反应过程、多细胞生物过程、代谢过程、发育过程、细胞内信号转导、正向生物调控过程；KEGG通路富集分析发现差异表达蛋白主要参与了局部黏附、紧密连接、细胞骨架调控、凋亡等通路。蛋白－蛋白相互作用分析发现肌球蛋白重链2、肌球蛋白重链7、肌球蛋白调节轻链、α辅肌动蛋白2、纤维蛋白原α链和纤维蛋白原β链6个关键蛋白。

结论

TAO继发限制性斜视患者与共同性斜视患者的眼外肌中蛋白表达存在差异，肌球蛋白、辅肌动蛋白、细丝蛋白可能通过参与细胞骨架调控、局部黏附等参与TAO的发病机制。

正 文

甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)为自身免疫性疾病[1,2]。眼外肌和眶脂肪等眼眶内组织以及甲状腺组织是免疫反应攻击的靶目标，可致眼外肌纤维瘢痕化、失去弹性和眶内软组织增容，进而导致不同程度眼球突出、眼睑闭合不全、眼睑退缩迟落，甚至压迫性视神经病变等系列眼部特征[3]。TAO常累及下直肌及内直肌，形成限制性下斜视和内斜视[4]。TAO患者常出现明显复视，严重影响患者的生活质量。TAO的具体致病机制尚不明确[5,6]。串联质谱标签(tandem mass tag，TMT)是一种多肽体外标记技术，采用多重同位素标签与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对10个不同样品中蛋白质的定性和定量分析。TMT具有定量准确、重复性好、灵敏度高等优点，被广泛用于差异表达蛋白分析研究中[7]。本研究拟采用蛋白质同位素标记定量分析技术联合液相色谱TMT技术对TAO继发限制性斜视眼外肌和共同性斜视眼外肌进行测定，筛选差异表达蛋白，并对这些蛋白的功能进行生物信息学分析，找出参与TAO发生和发展的潜在生物标志物，为进一步研究TAO的发病机制提供研究基础。

1材料与方法

1.1材料

收集2019年8月至2020年12月于北京大学人民医院眼科诊断为TAO、限制性斜视并行斜视矫正术患者共5例，术中收集眼外肌标本。纳入同期共同性内斜视并行斜视矫正术患者5例，术中收集眼外肌标本作为对照组。本研究方案经北京大学人民医院伦理委员会批准(批文号：2021PHB058-001)。

1.2方法

1.2.1TMT标记与质谱检测

1.2.1.1蛋白质酶解

取各组肌肉标本与裂解液和2粒钢珠放入研磨机研磨进行组织裂解，于4 ℃条件下20 000×g离心30 min，取上清；加入4倍体积预冷的TCA-丙酮，－20 ℃沉淀2 h以上；4 ℃条件下20 000×g离心30 min，加入3倍体积的纯丙酮，－20 ℃沉淀20 min；4 ℃条件下20 000×g离心30 min，此操作重复3次，清洗沉淀。在沉淀中加入裂解液，超声5 min助溶，超声条件为超声2 s，间隔3 s，功率180 W；4 ℃条件下20 000×g离心30 min，取上清，并采用Bradford法测定样本蛋白质量浓度。每组样本取30 μg裂解液，加入到10K超滤管中，于4 ℃条件下14 000×g离心40 min，弃废液；加入200 μl质量分数50%四乙基溴化铵(triethylammonium bicarbonate，TEAB)，于4 ℃条件下14 000×g离心40 min，弃废液。重复上述步骤2遍，加入1 μg/μl胰蛋白酶Trypsin，每100 μg蛋白底物加入3.3 μg酶，37 ℃水浴24 h。冻干消化液，每管使用25 μl 100 mmol/L TEAB复溶肽段。

1.2.1.2肽段TMT标记

从4 ℃取出标记试剂，并将其平衡至室温，每管标记试剂中加入41 μl乙腈，涡旋1 min。将混好的标记试剂加入到肽段中，不同样品用不同大小的同位素标记，混匀并室温静置1 h；加入8 μl质量分数5%羟胺，室温静置15 min。将样品混合并真空抽干。

1.2.1.3反相高效液相色谱分离

色谱柱为phenomenex Luna SCX 250 mm×4.60 mm 100Å，流动相中水相为95% H2O+5%乙腈，有机相为95%乙腈+5% H2O，均用氨水调至pH＝9.8。取1.2.1.2步骤抽干的样品，用1 ml水相溶解，4 ℃条件下15 000×g离心10 min，收集上清进行梯度洗脱，得到预分离的色谱图。出峰1 min后开始收集洗脱液，每30 s收集1管，将130 min洗脱液合并成10个组分并进行真空抽干。

1.2.1.4质谱检测及差异蛋白筛选

使用高精度液质联用型质谱(Q-Exactive-Orbitrap，美国Thermo Fisher公司)检测肽段信号，扫描质谱完成后得到质谱信号总图，再将其转换为mgf文件。应用Mascot软件(MASCOT 2.3.01)进行定性检索与定量分析。使用Swiss Human数据库物种名称，并用错误发现率1.2倍或P

1.2.2生物信息学分析

1.2.2.1蛋白注释方法

基于UniProtGOA数据库对差异表达蛋白进行基因本体(gene ontology，GO)分析注释。使用基于蛋白序列算法的软件Proteome Discoverer 1.4以及相应的InterPro结构域数据库对鉴定的差异表达蛋白进行蛋白结构域注释。

1.2.2.2蛋白质功能富集

蛋白质的功能富集分为GO富集分析、通路富集分析以及蛋白结构域富集分析3个部分。蛋白的GO注释被分为生物进程、细胞组分和分子功能。以鉴定到的蛋白为背景，采用Fisher精确检验评价差异表达蛋白。GO富集检验以PP

1.2.2.3蛋白质相互作用网络分析

以STRING(V.10.5)蛋白网络互作数据库为参照，将来源于不同比较组中的差异蛋白数据库编号或蛋白序列与之对比，按照置信度>0.7(高置信度)提取得到差异蛋白互作关系。并用CytoScape软件(版本号：3.2.1)生成相互作用网络连接。

2结果

2.1差异蛋白筛选

鉴定到总肽段谱图数量为24 265，肽段数量为9 140，唯一肽段数量为8 011，蛋白质数量为1 697。TAO组与对照组总差异表达蛋白数量53个，其中上调蛋白34个，下调蛋白19个(表1)。蛋白质定量火山图见图1。

红点代表表达上调蛋白，绿点代表表达下调蛋白，灰点代表无显著差异表达蛋白FC：差异倍数

图1差异表达蛋白火山图

表1TAO组与对照组眼外肌的差异表达蛋白

2.2差异表达蛋白功能信息学分析

2.2.1差异表达蛋白GO分析

从分子功能上看，差异表达蛋白具有结合和转运的功能；按生物学过程分类，这些蛋白主要参与了对刺激的反应过程、多细胞生物过程、代谢过程、发育过程、细胞内信号转导、正向生物调控过程；按细胞构成分类，这些蛋白主要定位于细胞内、胞浆、细胞外区域、细胞质中(图2)。

A：生物过程分析B：细胞组分分析C：分子功能分析

图2差异表达蛋白GO分析

2.2.2差异表达蛋白KEGG通路富集分析

细胞过程分类显示，差异表达蛋白主要参与雌激素信号通路、心肌细胞肾上腺能信号、心肌收缩、白细胞前移、胃酸分泌、寿命调节通路、血小板及胰液分泌；环境信息处理分类显示，差异表达蛋白主要参与糖化、氨基酸核磁、丙酮酸代谢、TCA代谢循环、维生素B12代谢、氮代谢、碳代谢。人类疾病分类显示，差异表达蛋白主要参与阿尔兹海默症、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、病毒性心肌病等；新陈代谢分类显示，差异表达蛋白主要参与钙通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路；生物体系统分类显示，差异表达蛋白主要参与局部黏附、紧密连接、细胞骨架调控、吞噬、凋亡等通路(图3)。其中显著富集的通路及相应差异蛋白见表2。

图3差异表达蛋白的KEGG富集通路分析

表2KEGG显著富集通路

2.2.3蛋白蛋白相互作用的调控网络

形成了一包含34个节点和85条边的复杂调控网络，平均节点度为5，聚类系数为0.524，发现肌球蛋白重链2(myosin heavy chain 2，MYH2)、MYH7、肌球蛋白调节轻链(myosin regulatory light chain 2，MYLPF)、α辅肌动蛋白2(α-actinin-2，ACTN2)、纤维蛋白原α链(fibrinogen α chain，FGA)和β链(fibrinogen β chain，FGB)6个关键蛋白(图4)。

图4蛋白－蛋白相互作用网络

3讨论

研究认为，TAO的靶点在眼眶成纤维细胞中，促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)被认为是Graves病的主要自身抗原，与正常对照相比，TAO患者眼眶成纤维细胞中TSHR mRNA的表达升高[8,9]。胰岛素样生长因子1受体(insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)是一种跨膜酪氨酸激酶受体，可以与TSHR形成物理和功能复合物，激活cAMP/PKA通路和PI3K通路等下游信号通路，促进眼眶成纤维细胞的活化[10,11]。活化的眼眶成纤维细胞增生活性增强，可产生炎性介质，分化为脂肪细胞和肌成纤维细胞，并产生过量的细胞外基质成分[1,6]。但目前TAO的发病机制尚未明确，本研究应用TMT蛋白组学方法对TAO继发限制性斜视患者的眼外肌和共同性内斜视患者的眼外肌进行测定和分析，筛选出差异表达蛋白，为深入研究TAO的发病机制奠定实验基础。

功能注释分析结果显示，差异表达蛋白主要参与了应激反应、代谢、细胞信号转导等过程。KEGG通路分析结果显示，差异表达蛋白主要参与了MAPK信号通路、FoxO信号通路、cGMP-PKG信号通路、局部黏附通路、细胞骨架调控、细胞凋亡等通路。结合蛋白－蛋白相互作用分析，发现TAO潜在的关键蛋白，如MYH2和MYH7、MYLPF、ACTN2以及FGA和FGB。

肌球蛋白是骨骼肌中分布最丰富的蛋白质，是粗肌丝的主要成分，在肌肉收缩和代谢中起重要作用，也是构成细胞骨架的重要成分。肌球蛋白是由1对重链和2对轻链构成；而后者则包括1对基本轻链和1对MYLPF[12]。基本轻链的作用主要是稳定重链结构，调节性轻链MYLPF在调节肌球蛋白的活性中发挥作用，肌球蛋白轻链必须缠绕在重链上才能保持其天然的活性构象。既往研究发现，肌球蛋白重链多个亚型以及调节轻链的功能与横纹肌收缩有关[13,14]，TAO患者中的MYH2、MYH7、MYLPF表达异常可能影响眼外肌纤维的收缩强度和速度，导致眼外肌功能异常。

肌动蛋白是细胞骨架的另一重要组成成分，其结构相对简单，并与肌球蛋白结合，构成了肌原纤维中的收缩蛋白[15]。ACTN2属于肌动蛋白交联蛋白，位于肌节Z盘中，充当反平行肌动蛋白丝之间的连接，并通过结合N末端肌动蛋白，加强肌节的稳定性。ACTN在稳定细胞黏附、调节细胞形状及细胞运动中发挥重要作用。ACTN2基因突变可导致不同类型先天性肌病的发生[16]。本研究发现在TAO患者的眼外肌中，ACTN2水平下调，提示ACTN2功能下降，可能破坏眼外肌的肌节稳定性，导致斜视的发生。

纤维蛋白原是由肝细胞合成并分泌的血浆蛋白凝血因子，参与机体凝血系统及感染和炎症过程[17]。甲状腺疾病和凝血系统关系密切[18]。研究提示纤维蛋白原与促甲状腺激素水平呈负相关，与游离甲状腺素T3和T4呈正相关[19]。本研究发现在TAO患者的眼外肌组织中FGA和FGB表达上调，可能与患者的甲状腺素水平有关。

细丝蛋白属于肌动蛋白结合蛋白，是一种重要的肌动蛋白交联剂[20]。细丝蛋白能与肌动蛋白结合，在调控细胞骨架的机械强度及可塑性方面起到重要作用。编码细丝蛋白的FLN基因突变可引起多个器官发育异常[21,22]。近年来研究表明，细丝蛋白在细胞与基质黏附和迁移的过程中起关键作用[21,23]。结合本研究的KEGG通路富集分析，发现细丝蛋白A和细丝蛋白C均参与了局部黏附通路和MAPK通路。彭娟等[24]检测到TAO患者眼外肌中黏附分子表达上调，提示细胞黏附通路在TAO发病中发挥作用。结合本次研究结果，提示细丝蛋白可能通过影响细胞黏附过程进而参与TAO的发生与发展。

既往研究证实，TSHR、IGF-1R、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)以及IL-10参与TAO的发病机制[25,26]。但本研究中，TAO组和对照组的眼外肌标本中未发现上述分子蛋白存在显著性差异。究其原因，眼外肌样本中TSHR免疫染色阳性细胞和TSHR mRNA表达在TAO疾病早期较高，随着疾病持续时间的延长而减少；同时与活动性Graves眼病患者相比，非活动性Graves眼病患者眼眶脂肪/结缔组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10等的mRNA表达水平较低[27,28]；本研究纳入的均为非活动期TAO患者，故TSHR、IGF-1R、IL-6和IL-10的蛋白表达水平上没有检测到明显差异。

综上，本研究利用TMT联合液相色谱串联质谱技术，对TAO继发限制性斜视眼外肌和共同性斜视眼外肌进行测定，筛选出53个差异表达蛋白，其中上调蛋白34个，下调蛋白19个；KEGG通路富集分析发现差异蛋白主要参与了局部黏附、紧密连接、细胞骨架调控、吞噬、凋亡等通路。未来还需以此次研究结果为基础，开展蛋白功能和信号转导通路的细胞生物学研究以进一步阐明TAO的发病机制，更有助于确定TAO治疗的潜在靶点。